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Malattie genetiche frequenti e rare. Le banche dati biomediche: OMIM, Pubmed, Orphanet, LOVD. Tipi di malattie genetiche, mendeliane, multifattoriali. Mutazioni: cause, tipi, posizione, effetti sul fenotipo. Nonsense mediated RNA decay e aploinsufficienza funzionale. Nomenclatura delle mutazioni; Varianti polimorfiche SNP/SNV, varianti sinonime e non sinonime in Genetica medica, farmacogenetica e nutrigenetica. SNP/SNV incidenza, effetti, CNV caratteristiche, effetti. Alberi genealogici, costruzione, strumento per la diagnosi di malattie genetiche. Malattie a trasmissione autosomica dominante: Esempi: Corea di Huntington, ipercolesterolemia familiare, sindrome di Marfan, Acondroplasia, Neurofibromatosi, sclerosi tuberosa, rene policistico dell’adulto, sindromi di Ehlers-Danlos, modalità di trasmissione, espressività variabile, penetranza incompleta, onset tardivo, sovrapposizione fenotipica. Malattie autosomico-recessive, esempi: albinismo, emocromatosi, anemia falciforme e talassemie, fibrosi cistica, sordità, fenilchetonuria, epidermolisi bollosa distrofica; Malattie X-linked recessive, esempi: distrofia muscolare di Duchenne/Becker, Favismo, Emofilia A, Malattia di Fabry, Cecità ai colori, Albinismo oculare. Malattie a trasmissione X-linked dominante, esempi: sindrome dell’X fragile, sindrome di Rett, rachitismo ipofosfatemico, sindrome di Alport, Incontinentia pigmenti, sindrome di Goltz, Sindrome di Aicardi; Segregazione dei tratti Y-linked; Malattie a trasmissione digenica: Retinite pigmentosa, malattia di Hirschprung, Glaucoma; Malattie a trasmissione mitocondriale, ereditarietà materna. Malattie mitocondriali dovute a mutazioni in geni del mtDNA, esempi: Neuropatia ottica ereditaria di Leber, Encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica e stroke, Lethal Infantile Mitochondrial Myopathy, Miopatia oculare discendente. Malattie mitocondriali dovute a mutazioni in geni nucleari, esempi: Sindrome di Leigh, Paraparesi spastica ereditaria, Atassia di Friedreich, Malattia di Wilson, Miopatia oculare autosomica dominante, Encefalopatia mio-neuro-gastrointestinale. Mutazioni dinamiche del DNA, meccanismi molecolari, replication slippage, anticipazione genetica, concetti di premutazione e mutazione; Malattie da grandi espansioni in sequenze geniche regolatrici, sindrome dell'X fragile; atassie spinocerebellari, Malattie da espansione di CAG nelle sequenze codificanti o da poliglutammina, esempi: Corea di Huntington, atassie spinocerebellari; Malattie da espansioni GCN nelle sequenze codificanti o di polialanina: esempi: Polisindattilia, Oloprosencefalia e sindromi malformative.
I test genetici: definizione, caratteristiche distintive rispetto ai test laboratoristici non genetici, consulenza genetica, impatto del risultato, consenso informato, controllo di qualità ISO9000, appropriatezza, indagini genetiche prenatali, cenni di fecondazione assistita e di analisi genetiche su singola cellula. Amniocentesi, villocentesi, cordocentesi per il prelievo di materiale biologico fetale. Test genetici non medici, indagini criminologiche, genetica di popolazione, indagine di paternità. Test farmacogenetici e nutrigenetici, categorie di test genetici per caratteri monogenici e complessi, consulenza genetica pre- e post-test, riservatezza, limiti e rischi del test genetico, referto del test genetico ed esempi. Test genetici ai minori, discriminazione e aspetti psicologici.
Metodi per lo studio degli acidi nucleici. Campioni biologici fonti degli acidi nucleici. Metodi per la purificazione, principi per l'estrazione. Protocolli per purificazione del DNA su membrana di silice. Principi di spettrofotometria e Nanodrop per la valutazione qualitativa e quantitativa del DNA purificato. Elettroforesi su gel d'agarosio per la valutazione semiquantitativa e qualitativa di frammenti di DNA, variabili che influenzano la velocità di migrazione in elettroforesi; colorazione e fotodocumentazione. Recupero del DNA da gel d’agarosio per PCR e sequenziamento. Southern e Northern blotting: metodologie, applicazioni in genetica umana e medica, utilizzo nell'attuale. Allele specific oligonucleotide (ASO). Clonaggio di sequenze codificanti per il sequenziamento di singoli alleli e per il recupero della funzione genica in cellule difettive e la conferma della patogenicità di varianti nucleotidiche ignote. PCR, sequenziamento del DNA con il metodo dei terminatori di catena di Sanger e MLPA: principi, utilizzo e potere di risoluzione dei tre metodi più comunemente usati nella diagnostica molecolare di malattie genetiche mendeliane. Interpretazione della patogenicità delle mutazioni.
Next Generation Sequencing, NGS, di II e III generazione, preparazione, amplificazione e sequenziamento di librerie genomiche con diverse tecnologie, i.e., pyrosequencing, Illumina, Ion Torrent, Helicos e Oxford nanopore. Approcci per definire la patogenicità delle varianti missenso e di splicing, Software Alamut visual. Principi e differenze dell’NGS rispetto al sequenziamento Sanger. Lezioni interattive "Caccia alla mutazione mediante metodo Sanger e NGS" per la presentazione dei tool bioinformatici per la ricerca del significato patogenetico di varianti genetiche.
Metodologie per lo studio dell'espressione genica: Q-PCR e microarray. Sequenziamento genomico, WGS, sequenziamento esomico, WES e di pannelli di geni, quando applicarli, a scopo diagnostico e di ricerca, risoluzione, limiti e problematiche. Metodo per il sequenziamento esomico con cattura degli esoni con RNA baits e mediante la tecnologia AmpliSeq. Esempi di WES. Esempi di malattie monofattoriali dalla clinica al test genetico. Il gruppo delle connettivopatie ereditarie: introduzione, raggruppamenti, il tessuto connettivo e i suoi componenti cellulari e molecolari, i collageni, la componente elastica, proteoglicani e glicosaminoglicani; interazione sopramolecolari tra i diversi costituenti della matrice extracellulare, le collagenopatie, le sindromi di Ehlers-Danlos, cenni storici, principali segni clinici comuni, la nosologia: 14 tipi, 20 geni. Iter diagnostico, diagnosi differenziale, test genetici, prevenzione, follow-up multidisciplinare, Sindrome di Ehlers-Danlos classico e ipermobile, dalla clinica al test genetico; diagnosi di routine e a scopo di ricerca. Vasculopatie monogeniche: Sindrome di Ehlers-Danlos vascolare, Sindrome di Marfan, Sindromi di Loeys-Dietz, vasculopatie non sindromiche, sindrome delle arterie tortuose: dalla presentazione clinica al test genetico e ai meccanismi patogenetici.